Identification of long non-coding RNAs that regulate apoptosis in human

Abstract

Apoptosis is essential for cellular homeostasis and normal development. Aberrant apoptosis (too much or too less) is associated with many important diseases such as autoimmune diseases and cancer. Studies have led to the identification of a number of proteins and microRNAs involved in the regulation of apoptosis. However, the role of long non-coding RNAs (lncRNAs) is still unclear. In this study, two cancer therapeutics drugs, cisplatin and doxorubicin, and two ligands, Fas mAb and TNF-alpha, were used in identification of differentially expressed pathway-drug specific and/or global lncRNAs in apoptotic HeLa cells. Following dose-kinetics experiments the level of apoptosis was measured by Flow Cytometry and was further verified by Fluorescence Microscopy and Western Blotting via measurement of Caspase 3, 8 and 9 protein levels. Three replicates of total RNAs (control and drug/ligand-treated cells) were sent to deepsequencing using the Illumina platform. The resulting reads matched to the human genome greater than 95%. Under our experimental setting, treatments with cisplatin, doxorubicin, Fas mAb and TNF-alpha led to the differential expression of 1644, 506, 584 and 807 lncRNAs, respectively (2-fold or higher, P < 0.01). Two of identified lncRNAs common for all inducers was in antisense position to TRAIL-R2 receptor and FasR associated factor which play directly in apoptosis. Results suggest that many lncRNAs are differentially expressed upon treatment with the indicated agents. Functional characterization of candidates might provide an interesting insight into regulation of apoptosis.

Hücre içi homeostazinin sağlanması açısından çok önemli olan apoptoz normal gelişimin yanı sıra otoimmun ve kanser gibi önemli hastalıklarla da bağlantılıdır. Biyokimyasal ve genetik analizler sonucu apoptozun kontrol mekanizmasında görev alan bir dizi protein ve mikroRNA’lar belirlenmiştir. Post-genomik çağdaki son çalışmalar genomda bir dönem ‘çöp’ DNA olarak belirlenen bölgelerden çok sayıda uzun kodlanmayan RNA’ların (ukmRNA) keşfine yol açmıştır. Bu çalışmada, apoptozun tetiklendiği HeLa hücrelerinde farklı ifade edilen ukmRNA’ların belirlenebilmesi için iki anti-kanser ilaç, sisplatin ve doksorubisin, ve iki ligant, TNFalpha ve Fas monoklonal antikoru, kullanılmıştır. Doz - ve zaman - kinetik deneylerini müteakip apoptoz seviyesi akış sitometresiyle ölçülmüş ve floresan mikroskopuyla sonuçlar teyit edilmiştir. Apoptozun tetiklendiğini doğrulamak için biyokimyasal olarak kaspaz 3, 8 ve 9 proteinlerinin seviyeleri ölçüldü. İllumina platformunu kullanarak derin sekans analizi yapabilmek için kontrol ve ilaç ile muamele edilmiş hücrelerden üçer replika toplam RNA örnekleri elde edildi. Sekans sırasında örnekler insan genomu ile %95 eşleşmiştir. Doksorubisin, sisplatin, TNFalpha ve Fas monoklonal antikoru muamelesi hücrelerde sırası ile 1644, 506, 584 and 807 adet ukmRNA’nın farklı ifade edilmesine neden olmuştur (an ez 2 kat, P < 0.05). Tüm ilaç muamelerinde ortak olarak faklı ifade edilen ukmRNA’lardan ikisi apoptozda önemli rol oynayan TRAIL-R2 reseptör ve FasR reseptöre bağlı öğe 1’ye (FAF1) antisens olarak bulunmuştur. Deneysel şartlarımız çerçevesinde sonuçlar ukmRNA’ların yukarıda belirtilmiş ilaçla muamele sırasında farklı ifade edildiğini göstermektedir. Adayların fonksiyonel karakterizasyonu ukmRNA’ların apoptozdaki rollerinin moleküler düzeyde anlaşılmasına yardımcı olacaktır.