Optimization of expression and isolation of a thermophilic P450 enzyme

Abstract

Cytochrome P450 enzymes (CYP or P450) are monooxygenases that catalyze the oxidation of hydrocarbons with high efficiency and selectivity, and many other reactions like hydroxylation, epoxidation, reduction, demethylation. CYP119, is a thermophilic P450 from Sulfolobus acidocaldarius. Thanks to thermophilic properties, CYP119 has potential to be widely used as a biocatalyst in production of fine chemicals and pharmaceuticals. However, production and purification of CYP119s is quite difficult and time consuming. Here, through recombinant protein production techniques, the optimum production and purification of heat-tolerant CYP119 has been successfully carried out. N-terminal and C-terminal histidine tags were cloned to CYP119. Protein expression was induced in Escherichia coli BL21 (DE3) cells with isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). δ-aminolevulinic acid (ALA) was also used to increase the heme biosynthesis. Different IPTG and ALA concentrations, expression temperature and duration were used to optimize production. CYP119 was isolated and purified with Ni-NTA affinity column. The thermostability of purified N (N-His-CYP119) and C (C-His-CYP119) terminal His-tagged were compared with wild type CYP119 (Wt-CYP119). Oxidation reaction of CYP119 and variants carried out and compared at 25 °C and 65 °C. Also, epoxidation of styrene was performed with N-His-CYP119 in different temperatures. The effects of histidine tags on stability and activity of the CYP119s were observed. Here, conditions for the production of CYP119 were optimized and the histidine tags were found to cause changes in stability and function of proteins. This project will lead to increase in the production of the important enzyme CYP119, which will increase its utilization in the industry.

Sitokrom P450 enzimleri (CYP veya P450) hidrokarbonların oksidasyonunu yüksek verimlilik ve seçicilikle katalizleyen ayrıca hidroksilasyon, epoksidasyon, redüksiyon, demetilasyon gibi pek çok reaksiyonu olan monooksijenez enzimleridir. CYP119, Sulfolobus acidocaldarius arkesinden elde edilen asidotermofilik bir P450 enzimidir. CYP119 termofilik özelliği sayesinde ince kimyasalların ve farmasötiklerin üretiminde bir biyokatalizör olarak yaygın bir şekilde kullanılma potansiyeline sahiptir. Ancak tüm bu özelliklerinin yanında CYP119’un üretimi ve saflaştırılması oldukça zor ve zaman alıcıdır. Bu çalışmada, recombinant protein üretimi teknikleri sayesinde termofilik CYP119’un optimum üretimi ve saflaştırılması başarıyla gerçekleştirildi. CYP119 DNA’sına N-terminal ve C-terminal histidin etiketleri klonlandı. Protein ekspresyonu izopropil β-D-l-tiyogalaktopiranosid (İPTG) ile Escherichia coli BL21 (DE3) hücrelerinde indüklendi. Ayrıca hem biyosentezini artırmak için δ-aminolevülinik asit (ALA) kullanıldı. Üretimi optimize etmek için farklı IPTG ve ALA konsantrasyonları, ekspresyon sıcaklıkları ve süreleri kullanıldı. CYP119, Ni-NTA afinite kolon ile izole edildi ve saflaştırıldı. Saflaştırılan N (N-His-CYP119) ve C (C-His-CYP119) terminal Histidin etiketli CYP119’ların termostabiliteleri doğal yapıdaki CYP119’un (d-CYP119) termostabilitesi ile karşılaştırıldı. CYP119 ve varyantlarının oksidasyon tepkimeleri 25 °C ve 65 °C’de gerçekleştirildi ve karşılaştırıldı. Ayrıca N-His-CYP119’un epoksidasyonu HPLC ile farklı sıcaklıklarda izlendi. Tüm bunların yanı sıra izolasyonu kolaylaştırmak için CYP119’ un hem N terminaline hem de C terminaline klonlanan Histidin etiketlerinin termostabiliteye ve aktiviteye olan etkileri araştırıldı. Çalışmanın sonunda CYP119 üretimi için koşullar optimize edildi ve Histidine etiketinin proteinlerin kararlılığında ve fonksiyonlarında değişikliklere yol açtığı bulundu. Bu çalışma sayesinde CYP119 gibi oldukça önemli enzimlerin ilaç ve kimya sanayinde kullanımlarında artış sağlanacak ve protein izolasyonunda sıklıkla kullanılan Histidin etiketleri daha dikkatli kullanılacaktır.