CYR61-notch interaction during epithelial-to-mesenchymal transition, migration and invasion in breast cancer cells

Abstract

Notch signaling is one of the major pathways involved in development and tumorigenesis. Activated Notch is correlated with increased migration, invasion and epithelial-to-mesenchymal-transition (EMT) in breast cancer. However, mechanism of Notch-mediated cancer progression is poorly understood. CYR61 is a secreted protein and its upregulation is also related to increased breast tumorigenesis and EMT. Microarray analyses revealed that CYR61 was differentially expressed in response to Notch activation in breast epithelial cells. We hypothesized that CYR61 is a downstream mediator of Notch during EMT, migration and invasion. To test whether Notch requires CYR61 during EMT, migration and invasion, two complementary approaches were followed: (i) CYR61 expression was silenced by using shRNA in MCF10A epithelial breast cell line in the presence of Notch activation, (ii) CYR61 was over-expressed in MDA-MB-231 cancer breast cell line in the absence of Notch activity. Then, expression of EMT markers was analyzed in mRNA and protein levels via RT-qPCR and immuno-blotting, respectively. Migration and invasion ability of cells were investigated by wound healing assay and a lab-on-a-chip-system, respectively. Here, it was shown that CYR61 inhibition decreased Notch-induced EMT, migration and invasion of MCF10A and CYR61 overexpression in the absence of Notch activity partially rescued Notch-mediated invasion in MDA-MB-231 cell lines. Our findings suggest that CYR61 may act in downstream of Notch and is regulated by Notch. When we consider importance of CYR61 in Notch-induced EMT and cancer progression, targeting CYR61 may hold promise to develop novel strategies for treatment of breast cancer in early stages.

Notch sinyal yolağı gelişim ve tümör oluşumunda yer alan ana yolaklardan biridir. Notch aktivasyonu meme kanserinde migrasyon, invazyon ve mezenkimal geçiş (EMT) ile ilişkilidir. Fakat Notch aracılığıyla kanser gelişiminin mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. CYR61 salgılanan bir proteindir ve fazla ifadelenmesinin meme tümörleşmesi ile ilgili olduğu bilinmektedir. Microarray analizi CYR61 geninin Notch aktivasyonuyla farklı ifadelendiği açığa çıkarmıştır. Bu tez çalışmasında, CYR61’in EMT, migrasyon ve invazyon sırasında Notch alt aracısı olduğu hipotez edilmiştir. Notch yolağının EMT, migrasyon ve invazyon sırasında CYR61 e ihtiyacı olup olmadığını anlamak için iki tamamlayıcı yaklaşım takip edildi: (i) MCF10A epitelyum meme hücre hattında Notch varlığında CYR61 ifadelenmesi shRNA kullanılarak susturuldu, (ii) MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattında Notch eksikliğinde CYR61 fazla ifadelendi. Sonrasında, EMT belirteçlerinin ifadelenmesi mRNA ve protein seviyesinde sırasıyla RT-qPCR ve immün-blotlama yöntemleriyle analiz edilmiştir. Hücrelerin migrasyon ve invazyon yetenekleri sırasıyla yara iyileşme analizi ve lab-ona- chip sistemi ile araştırıldı. Burada, CYR61’in MCF10A hücre hattında Notch tarafından indüklenen EMT, migrasyon ve invazyonda önemli olduğu ve Notch aktivitesi olmadığında CYR61 in fazla ifadelenmesinin Notch tarafından indüklenen invazyonu MDA-MB-231 kanser hücrelerinde kısmi olarak kurtardığı gösterilmiştir. Bu bulgular CYR61 in Notch yolağının alt mekanizmasında rol alabileceğini ve Notch tarafından kontrol edilebileceğini önermektedir. CYR61’in Notch tarafından indüklenen EMT ve kanser gelişimdeki önemi düşünüldüğünde, CYR61’in hedef alınması, meme kanserini erken aşamalarda tedavi etmek için yeni tedavi stratejileri geliştirmede ümit vaat etmektedir.