Identification of molecular resistance mechanisms against systemically used antifungal drugs, amphotericin B and caspofungin

Abstract

The invasive fungal infections have been evolving for the last few decades and become a crucial factor that negatively affects the survival ability of the patients. Moreover, developing new resistance mechanisms of infectious organisms to the antifungal drugs make this problem more critical. In this study, we identified four different genes PDR16 and PMP3, RMD9 and SWH1which are resistant to amphotericin B and caspofungin, respectively, in Saccharomyces cerevisiae. We also screened whole yeast genome at transcriptional level via microarray analysis and identified metabolic pathways affected by these antifungal drugs. In addition, we applied several characterization methods including physiological and morphological analyses to understand the resistance mechanisms. We found that rmd9 mutants were extremely hyperpolarized and pdr16 and pmp3 mutants were depolarized when compared to control group. In contrast, overexpression of SWH1 increased the membrane potential of wild type cells. Further analyses showed that the absence of RMD9 disrupts the cellular morphology. To show that these genes are clinically important, Candida albicans orthologs of PDR16 and PMP3 were cloned and their roles in amphotericin B drug resistance were confirmed. RMD9 and SWH1 have no known C. albicans orthologs, so the confirmation with pathogenic yeast genome could not be performed against caspofungin.İnvazif mantar enfeksiyonları son yıllarda evrilerek hastanın hayatta kalma sürecini olumsuz yönde etkileyen önemli bir faktör haline gelmiştir. Bununla birlikte, enfeksiyöz organizmalar tarafından mantar ilaçlarına karşı geliştirilen yeni mekanizmalar bu problemi daha da kritik hale getirmektedir. Ekmek mayası Saccharomyces cerevisiae ile yapılan bu çalışmada; genomik DNA taraması sonucu PDR16 ve PMP3 genlerinin amfoterisin B’ye; RMD9 ve SWH1 genlerinin ise kaspofungine karşı dirençlilik sağladığı tespit edilmiştir. Ayrıca tüm maya genomunun transkripsiyon düzeyinde yapılan mikrodizi taraması ile bu mantar ilaçlarının hangi metabolik yolakları etkilediği belirlenmiştir. Dirençlilik mekanizmalarının anlaşılmasında karakterizasyona yönelik fizyolojik ve morfolojik testler uygulanmış; kontrol grupları ile yapılan karşılaştırmalar sonucunda rmd9 mutantının belirgin bir biçimde hiperpolarize olduğu, pdr16 ve pmp3 mutantlarının ise depolarize olduğu gözlenmiştir. Diğer yandan, SWH1 geninin aşırı ifadelenmesi de yabani tip hücrelerin membran potansiyelinde artışa sebep olmuştur. Yine yapılan karakterizasyon testleri sonucunda rmd9 mutant hücrelerinde morfolojik açıdan anomaliteler saptanmıştır. Bu çalışmanın klinik açıdan önemini vurgulamak amacıyla PDR16 ve PMP3 genlerinin Candida albicans ortologları klonlanmış ve amfoterisin B mantar ilacına olan dirençlilikleri gösterilerek, elde edilen bulgular desteklenmiştir. RMD9 ve SWH1 genlerinin C. albicans homologları veri tabanında mevcut olmadığı için, genlerin dirençlilikleri patojenik maya genomuyla test edilememiştir.