Bedir, ErdalBallar, PetekÜner, Göklem2023-11-132023-11-132019-07http://standard-demo.gcris.com/handle/123456789/3763Thesis (Master)--Izmir Institute of Technology, Biotechnology, Izmir, 2019Full text release delayed at author's request until 2020.02.23Includes bibliographical references (leaves: 127-150)Text in English; Abstract: Turkish and EnglishSince antitumor potency of saponins is relatively weak, researchers focus on semi-synthetic modification of saponins to obtain highly potent structures. With the same motivation, we prepared cytotoxic sapogenol (AG-08), from cycloastragenol. Our preliminary studies revealed that AG-08 was inducing necrotic cell death together with autophagic inhibition. Furthermore, immunoblotting experiments suggested that AG-08 promoted cleavage of various proteins. A continuation study was performed in this thesis with aims of: i) verifying previous studies; ii) identifying molecular mechanism of AG-08; iii) preparing further analogs of AG-08 and deduce structure activity relationships(SAR). Accordingly, necrotic cell death and autophagic inhibition via AG-08 was verified, and cytotoxicity of AG-08 on 13 cell lines was examined. Furthermore, inhibitors of calpain-1, general caspases, cathepsin B/L/S, and caspase-8 were found to partially alleviate cell death, whereas cathepsin D/E inhibitor were not able to do. Additionally, lysosomal impairment due to loss of acidic nature was demonstrated. Later data and effect of cathepsin inhibitor on AG-08 mediated cell death suggest lysosomal membrane permeabilization. In synthesis part, 15 AG-08 analogs were prepared, three of which were cytotoxic. Additionally, active analogs triggered similar cell death mechanism with AG-08. SAR evaluation reveals that presence of tosyl, and tetrahydrofuran ring are required for activity, while double bond at C-6 is not essential. Consequently, this thesis provides important data on mechanism of necrotic cell death and autophagic inhibition via AG-08 treatment as well as relationship between structure and activity. However, further studies are warranted to clarify complete mechanism of AG-08 and substantiate structure activity relationship deductions.Yarı-sentez çalışmaları, göreceli olarak düşük anti-tümör aktiviteye sahip saponinlerden yüksek potansiyele sahip yeni moleküller elde etmek için sıklıkla kullanılır. Bu amaçlar ile yürüttüğümüz bir proje kapsamında sikloastragenolden sitotoksik bir sapogenol analoğu olan AG-08 elde edilmiştir. Ön çalışmalarımız AG-08’in nekrotik hücre ölümüne ve otofaji inhibisyonuna neden olduğunu göstermiştir. Ayrıca immunoblotlama çalışmaları PARP-1, p62 ve ATG proteinlerinin AG-08 uygulaması ile kesildiğini işaret etmiştir. Bu tezin temel amaçları; i) ön dataları doğrulamak, ii) AG-08’in moleküler mekanizmasını aydınlatmak, iii) AG-08 analogları hazırlayıp yapı-aktivite ilişkisi kurmaktır. Bu kapsamda yapılan çalışmalar ile AG-08 aracılı nekrotik hücre ölümü ve otofaji inhibisyonu kanıtlanmıştır. Ayrıca 13 insan hücre hattı ile sitotoksisite taraması yapılarak AG-08’in seçiciliği araştırılmıştır. Çalışmalarımızın devamında kalpain, genel kaspaz, katepsin B/L/S ve kaspaz-8 inhibitörlerinin AG-08 aracılı hücre ölümünü zayıflatırken, katepsin D/E inhibitörünün etkilemediği görülmüştür. Lysotracker boyaması ile AG-08’in lizozomun asidik pH’sını kaybetmesine neden olduğu gösterilmiştir. Katepsin inhibitörlerinin hücre ölümü üzerine etkisi ve lizozomal bazifikasyon, AG-08’in lizozomal membran geçirgenliğine neden olduğunu işaret etmektedir. Yarı-sentez çalışmalarında ise 15 AG-08 analoğu sentezlenmiş ve bunlardan üç tanesi sitotoksik bulunmuştur. Devam çalışmaları üç analoğunda AG-08 ile benzer bir moleküler yolağı aktive ettiğini kanıtlamıştır. Oluşturulan yapı-aktivite ilişkisi, tosil grubunun ve tetrafuran halkasının aktivite için önemli olduğunu ancak C-6 ve C-7 arasındaki çift bağın önemli olmadığını ortaya koymuştur. Sonuç olarak, bu tez ile hem AG-08 aracılı hücre ölümünün moleküler yolağı ile ilgili hem de AG-08 ve analoglarının yapı-aktivite ilişkisi ile ilgili önemli bilgiler elde edilmiştir. Bununla birlikte, moleküler mekanizmanın tam olarak aydınlatılması ve yapı-aktivite ilişkisinin doğrulanması için ileri çalışmalar gerektiği açıktır.xvi, 152 leaveseninfo:eu-repo/semantics/openAccessRegulated necrosisAutophagySaponinSemi-synthesisMaster Thesis